ELISA（酶联免疫吸附法）检测

提倡新鲜标本尽早检测，对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，请造模取材后，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差，蛋白极易降解，直接影响实验质量，所以避免反复冻融。

样本包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等：

血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

尿液：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

实验步骤

1、包被抗原：稀释液pH 9.6 碳酸盐缓冲液，多肽浓度2ug/ml，0.1ml/孔，4ºC过夜，洗净。

2、1%BSA (pH 9.6 碳酸盐缓冲液) 封闭，0.1ml/孔，37ºC1h，洗净。

3、稀释抗血清(可稀释不同浓度) 0.1ml/孔，37ºC 30分钟，洗净。

4、稀释辣根过氧化物每标记的二抗 0.1ml/孔，37ºC 40分钟，洗净。

5、显色：TMB显色。A液：四甲基联苯胺10mg 溶于DMF1ml中，再用pH5.0柠檬酸缓冲液稀释100倍。B液：5ul双氧水加蒸馏水12.5ml 。终止液：2N硫酸。

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