小鼠血管平滑肌细胞原代培养
方法:
1) 10%水合氯醛2ml腹腔注射麻醉小鼠,浸泡在75%乙醇中。
2) 在无菌条件下打开胸、腹腔,暴露心脏,依次剪去胸腹腔器官直至暴露主动脉,完整分离主动脉,放入35mm无菌平皿中,加入1 ml无菌PBS( pH 7.2) ,迅速转移至超净台。
3) 用D-Hanks液反复冲洗,去除残留血液,用镊子小心剥离主动脉外的脂肪组织,小心剥去外膜,至血管光滑透明。
5)将主动脉放入DMEM液(含4.5g/L葡萄糖,10mmol/L丙酮酸,2mmol/L谷氨酰胺,100U/L的青霉素及链霉素,20%胎牛血清)中,用眼科剪纵行剪开主动脉,用刀片轻刮内膜2~3遍以去除内膜。
6)将剥离的血管转入另一个装有3ml含20% FBS DMEM/F12培养液的35mm无菌平皿中,用眼科剪剪碎,碎片大小1 mm×1 mm左右。
7) 将组织块均匀种植于培养瓶底,轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上,加入2 ml 含20% FBS的新鲜DMEM/F12培养基;
8) 置于37℃、5%CO2细胞培养箱中静置4~5h使小块微干涸,待组织块牢固贴附于细胞瓶底,再轻轻翻转培养瓶,使组织块完全浸没于培养液中。
9) 放入含5%CO2的37 ℃培养箱,静止培养3 d,观察后换液。
10) 待细胞长满培养瓶底面积80%后,用0.25%的胰酶消化传代,传代2h后吸取上清液接种于另一培养瓶中,24 h后根据细胞贴壁情况收取未贴壁细胞悬液,离心5min,重悬后接种到新的培养瓶中,反复多次差速贴壁法纯化细胞,实验用第5~8代细胞。
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