外周血淋巴细胞的原代培养

淋巴细胞主要来源：脾脏、外周血等

外周血单个核细胞：淋巴细胞+单核细胞

分离方法：密度梯度离心法，因为血液中各成分的比重存在差异，因此得以分离。第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为白细胞层；第五层红细胞。

方法：

（1）眼球取血，将血液滴入肝素抗凝管中，加入PBS按1：1稀释血液（一般采血管2mL+2mL）。

（2）取淋巴细胞分离液2mL于15mL灭菌离心管中待用。

（3）吸取稀释血液，在离分层液上方25px处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。

4）室温，离心2000rpm，20min。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。

5）小心吸取中间呈白膜状的淋巴细胞层，尽量全部吸出。加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。

6）去上清液，加入1640培养基1mL混匀，取少量进行细胞计数。

7）用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：活性应在95％以上。

8）接种后培养，条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。3d后，每48h添加等体积的新鲜培养基。

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