小鼠脑微血管内皮细胞分离培养

1.C57小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培养皿中解剖去除小脑、间脑(包括海马)。

2. 随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培养皿中，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。

3. 用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培养液，用虹膜剪将其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型胶原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大脑)混匀后37 ℃水浴消化1.5 h。

4. 离心(1 000 rpm，5 min，室温)，去上清液，加入20% BSA悬浮混匀后离心(1000 g，20 min，4 ℃)，去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀。

5. 加入3 ml  2.5%胰酶消化液消化20min，加入等量含血清培养基终止消化，离心(1 000 rpm，8 min，室温)，去上清液，加入2 ml DMEM培养液悬浮后铺于经离心形成连续梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。

6. 离心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗两次(离心1 000 rpm，5 min，室温)，去上清液。

7. 加入DMEM完全培养液(含20% FBS)悬浮后接种于涂布基质的35 mm一次性塑料培养皿(1.5 ml/培养皿，可接种1个培养皿/大脑)，置于37 ℃、5%CO2培养箱内静置培养，12~24 h后换液，并加入1 ng/ml bFGF，随后隔天换液。

细胞形态：脑微血管内皮细胞原代培养过程中，约24h即可贴壁生长，细胞呈长梭形生长缓慢。换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，5- 7d  70%-80%可融合达到传代标准。

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