大鼠肝细胞原代分离培养

（1）麻醉及灌流：将大鼠以7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作台，0.45mm头皮针连接蠕动泵，打开蠕动泵，调整蠕动泵灌流速度为7ml/min，抽取37℃预热的灌流液I并排空装置内的空气。打开腹腔，将胃肠结构推向左腹上侧，分离出下腔静脉（肾上段）、肝门静脉，剪开隔膜，动脉夹夹闭下腔静脉肝上段，将头皮针插入下腔静脉（肾上段），动脉夹夹闭固定，打开蠕动泵，灌注37℃预热的灌流液I，确定肝脏均匀膨胀后剪开肝门静脉，继续灌流至肝脏变成土黄色且肝门静脉剪断处流出无色灌流液为止，更换预先预热的37℃灌流液II，直至肝脏表面出现白色裂纹时停止灌流。剪下肝脏，置于无菌D-Hanks溶液中。

（2）肝细胞的收集：将肝脏在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培养基中，眼科镊撕开肝包膜，此时肝细胞会分散在培养基中，然后用200目不锈钢细胞筛过滤，将滤液转移至15ml无菌离心管。

（3）肝细胞纯化：将收集的滤液以800rpm离心5min，弃去上清，用高糖DMEM完全培养基重悬细胞，用200目不锈钢细胞筛再次过滤，离心收集细胞沉淀。用高糖DMEM肝细胞生长培养液重悬细胞。

（4）肝细胞计数及活力检测：取0.1ml肝细胞悬液与0.1ml PBS、0.1 ml40g/l的台盼蓝储备液混合后，用血细胞计数板计数收获的肝细胞总量及存活率。

（5）将肝细胞悬液调整细胞5x105/ml接种于铺有鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24h后换液，用高糖DMEM肝细胞生长培养液继续培养。后续隔天换液培养。

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