完全性基因敲除鼠

技术原理：

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。CRISPR是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑，目前已经成功应用于大、小鼠基因KO/KI的模型制备。

技术特点：

（1）无物种限制

（2）靶向精确性更高

（3）可实现对靶基因多个位点同时敲除

（4）基因调控方式多种多样

（5）修饰效率高，实验周期短

通过CRISPR /Cas9基因敲除技术，针对靶基因设计和构建gRNA与Cas9表达质粒，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。

移码突变鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠；

2、F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠；

3、选择来自同一只F0代鼠，基因型一致的F1代鼠，达到性成熟后进行互配，可获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代鼠中25%为纯合子， 50%为杂合子，25%为野生鼠。

片段基因敲除鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因不同位点设计、构建相应的一对gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠；

2、F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配，获得PCR鉴定阳性的F1代杂合子鼠；

3、选择来自同一只F0代鼠，基因型一致的F1代鼠，达到性成熟后互配，可获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代鼠中25%为纯合子，50%为杂合子，25%为野生鼠。

双（多）基因敲除鼠的建系原则与流程

1、通过针对两个靶基因分别设计、构建相应的gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代多基因杂合子鼠；

2、F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代双基因杂合子鼠；

3、选择双基因杂合子鼠进行杂交，获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定。

【服务流程】

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【威斯腾生物服务项目】

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【本平台合作项目】

分子生物学、细胞生物学、病理染色检测、细胞敲除/敲入、模式与转基因动物、SPF动物保种、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、siRNA与纳米载药、ChIP、Co-IP、生物信息学分析、知识产权服务！

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