膝关节软骨细胞原代培养

实验步骤

（1）取四周龄SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上；

（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离大腿腿骨，尽可能去除筋膜、肌肉和结缔组织；从关节处分离出软骨组织，将其剪成小于1mm³的组织块，用含双抗的PBS溶液冲洗两遍；

（3）软骨组织块静置5min，弃去上层液体及悬浮组织，往离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化15-20min；

（4） 4℃静置5min，弃上清，加入0.2%胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化30～60min；
（5）加入生长培养基终止消化，反复吹打后依次通过200目滤网，收集滤液,1200rpm离心8min，弃上清，用DMEM完全培养基重新悬浮细胞, 放入37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养；

（6）放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养，每3天更换培养液至第5天改为无血清培养液，免疫组化鉴定原代细胞。

细胞形态

膝关节软骨原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞三角或多角形，生长缓慢，培养3-5天进入快速增殖期。

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